Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN

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作者：J. Dauparas, I. Anishchenko, N. Bennett, …, D. Baker

Science，2022 年 10 月 7 日

导读

蛋白质序列设计——给定目标骨架结构，寻找能折叠成该结构的氨基酸序列——是蛋白质工程的核心问题。传统方法依赖 Rosetta 等物理能量函数，计算成本高且需要专家手动调参。华盛顿大学 David Baker 实验室开发的 ProteinMPNN，基于消息传递神经网络，将设计速度提升两个数量级，天然序列恢复率从 32.9% 提高到 52.4%，并通过 X 射线晶体学、冷冻电镜和功能实验系统验证了设计蛋白质的正确折叠和生物活性。

一、研究问题

蛋白质设计的一个核心子问题被称为”逆折叠”：给定目标三维骨架坐标，找到一条氨基酸序列使其折叠成该结构。这一问题的困难在于：一个骨架通常对应多条可行序列，不存在唯一答案；局部残基之间存在复杂的空间相互作用；多聚体还需要同时优化链内和链间界面。Rosetta 等传统方法将此建模为物理能量优化问题，显式搜索大量侧链 rotamer 组合以寻找能量最低的序列。对于一个 100 残基蛋白质，Rosetta 单次设计需要约 4.3 分钟（单 CPU），且往往需要人工制定疏水残基分布、界面约束等规则。更关键的是，物理方法优化的只是目标构象中的能量，无法直接排除所有可能的错误折叠和聚集状态。在 Rosetta 的设计流程中，对表面疏水残基的限制、核心与边界区域的不同处理等通常需要丰富的领域专业知识，这大大限制了方法的普及和可重复性。

在 ProteinMPNN 之前，已有基于深度学习的逆折叠方法被提出，但它们主要面向单体蛋白质设计，在多链体系和对称结构上适用性有限，且缺乏系统的实验验证。ProteinMPNN 的目标是构建一个通用的深度学习序列设计工具，同时满足两个要求：广泛适用于单体、多聚体、对称体、纳米颗粒和功能蛋白等多种设计场景；通过结晶学、电镜和生化等多种实验手段，系统验证设计蛋白质的正确折叠与功能。

二、方法核心：ProteinMPNN 的核心方法

ProteinMPNN 将蛋白质表示为空间图：每个残基为一个节点，空间上相近的残基对构成边。模型以主链原子 N、Cα、C、O 和虚拟 Cβ 之间的距离作为输入特征。相比仅使用 Cα 距离或二面角的早期方法，这种丰富的原子间距离表示将序列恢复率从 41.2% 提升至 49.0%，是所有模型改进中贡献最大的一项。在此基础上引入编码器边特征更新，将恢复率进一步提高到 50.5%。

网络由 3 层编码器和 3 层解码器组成，隐藏维度 128，每个残基连接 32–48 个空间近邻。作者测试了 16 到 64 个近邻的不同设置，发现性能在 32–48 个邻居时饱和，表明序列选择主要由局部空间环境决定。编码器在图上反复传递消息，使每个位置获得其是否位于疏水核心、链间界面或暴露表面等三维环境信息；解码器以自回归方式逐步生成序列。训练数据包括 PDB 中 2021 年 8 月前分辨率优于 3.5 Å、残基数少于 10,000 的蛋白质组装体结构，经 MMseqs2 按 30% 序列一致性聚类后得到 25,361 个聚类。

随机解码顺序是 ProteinMPNN 的关键创新之一。传统自回归模型固定从 N 端到 C 端生成序列，在生成前端位置时无法利用后端已固定的功能位点信息。例如在蛋白质结合物设计中，靶标链序列已经确定，某些功能位点必须保留，只需要设计其余位置。固定解码顺序的模型难以充分利用这些已知信息。ProteinMPNN 在训练时从所有可能的排列中随机采样解码顺序，因此推理时可灵活选择解码策略：先将固定位置作为已知上下文输入，跳过这些位置，再设计剩余位置。这使模型能够处理保留催化残基、固定配体结合基序、只重设计部分区域、固定靶标链设计结合蛋白等多种实际需求。

对于同源多聚体设计，ProteinMPNN 提供了优雅的对称位置绑定机制。以同源三聚体为例，三条链中对称位置的氨基酸必须相同。模型对三个等价位置分别根据各自的局部三维环境计算 logits，然后取平均后从统一概率分布中采样，将同一氨基酸同时赋给三个对称位置。实测表明，平均 logits 策略使同源多聚体的中位恢复率达到 55%，优于不加对称约束的 52% 和平均概率的 53%。同一绑定机制具有广泛适用性：内部重复蛋白可以绑定各重复单元的对应位置；环状多聚体可以同时施加链间对称和链内重复约束；蛋白质纳米颗粒中多份等价亚基可以共享同一序列；甚至可以通过加权组合不同骨架的 logits 实现多状态设计，用正权重鼓励序列兼容目标构象、用负权重抑制不需要的状态。

三、看图说话

Figure 1 · 编码器-解码器架构

这张图想回答：ProteinMPNN 的架构怎样处理骨架几何、怎样生成序列？

Figure 1. ProteinMPNN 架构。(A) 把 N、Cα、C、O 和虚拟 Cβ 之间的距离编码后用消息传递网络处理。(B) 编码器-解码器框架，支持随机解码顺序和对称位置绑定。

把蛋白表示成空间图（残基为节点、近邻连边），输入 N、Cα、C、O 和虚拟 Cβ 之间的距离。这组丰富的原子间距离把恢复率从 41.2% 提到 49.0%，是所有改进里贡献最大的一项。3 层编码器 + 3 层解码器、每残基连 32–48 个近邻。

两个关键创新：随机解码顺序（训练时随机采样生成顺序，推理时能先固定已知功能位点、再设计其余，支持保留催化残基、固定靶标链设计结合蛋白等）；对称位置绑定（同源多聚体对称位置分别算 logits 再平均后采样，中位恢复率 55% 优于不加约束的 52%），还能扩展到重复蛋白、纳米颗粒、多状态设计。

Figure 2 · 计算评估

这张图想回答：序列恢复率在不同训练策略和采样温度下如何？噪声训练有什么用？

Figure 2. ProteinMPNN 的计算评估。(A) 恢复率高于 Rosetta。(B) 骨架噪声训练的效果。(C) 采样温度与序列多样性。(D) AlphaFold 结构预测验证。

• Panel A：402 个单体骨架上天然序列恢复率 52.4%，远超 Rosetta 的 32.9%（深埋核心 90–95%、暴露表面约 35%）。速度上 100 残基约 1.2 秒，比 Rosetta 快约 200 倍。
• Panel B：加骨架噪声训练会略降完美结构上的恢复率，但在 AlphaFold 预测骨架上反而更好、设计序列折回目标的成功率提高 2–3 倍——鲁棒性比恢复率更有意义。Panel C/D：温度控制多样性；ProteinMPNN 序列通常被 AlphaFold 更高置信度地预测回目标骨架（天然序列还受功能/调控等约束，不只优化稳定性）。

Figure 3 · 实验表征

这张图想回答：设计序列真能可溶表达、热稳定、结晶成目标结构吗？

Figure 3. ProteinMPNN 设计的结构表征。(A) 可溶表达对比。(B) 热稳定性。(C) 晶体结构。(D) 纳米颗粒组装。

策略很严格：专门挑之前 Rosetta/AlphaFold 设计失败的蛋白，保留骨架、只换序列。AlphaFold hallucination 的 129 个骨架上原序列大多不溶（中位 9 mg/L），ProteinMPNN 重设计后 96 个里 73 个可溶表达、中位产量 247 mg/L（约 27 倍），95°C 仍保持二级结构。

晶体结构（PDB 8CYK，130 残基新颖折叠）与设计目标 RMSD 仅 2.35 Å；环状多聚体可溶比例 88%（Rosetta 40%）；纳米颗粒设计 13 个形成约 1 MDa 组装体、晶体验证偏差 1.2 Å。整个序列设计全自动、每骨架约 1 秒。

Figure 4 · 功能蛋白设计

这张图想回答：保留功能基序、只重设计支架，能设计出有结合功能的蛋白吗？

Figure 4. 用 ProteinMPNN 设计功能。(A) 设计方案：把富脯氨酸肽嵌入螺旋束、重设计支架、再做 N→D 突变对照。(B) 不同浓度下的 Octet（BLI）结合曲线。

最难的测试：设计能结合人 Grb2 SH3 结构域的蛋白——把富脯氨酸肽基序嵌进螺旋束支架。原始 Rosetta 序列无结合；ProteinMPNN 保留骨架和基序、只重设计周围支架后，BLI 测到比游离肽更强的结合信号（Panel B 第三格信号随浓度明显上升）。关键对照：把两个参与氢键网络的 Asn 突变成 Asp（N→D）后结合信号几乎消失，证明结合确实依赖 ProteinMPNN 设计的特定相互作用，而非非特异吸附。

四、核心贡献总结

ProteinMPNN 的贡献可以归纳为三点。

用深度学习替代物理能量函数做序列设计。把逆折叠建成骨架图上的消息传递，天然序列恢复率 从 Rosetta 的 32.9% 提到 52.4%，速度快约 200 倍，且不需要人工制定疏水分布等规则。

随机解码顺序 + 对称绑定带来通用性。同一个模型覆盖单体、多聚体、对称体、纳米颗粒、功能蛋白、固定靶标的结合蛋白等多种场景。噪声训练让设计对坐标扰动更鲁棒，折回目标的成功率提高 2–3 倍。

完整的实验证据链。专挑之前设计失败的骨架、只换序列，可溶产量提升约 27 倍，晶体结构、纳米颗粒组装、SH3 结合功能都得到验证，形成「设计合理→指标提高→可表达折叠→结构符合→功能实现」的闭环。

五、局限与展望

ProteinMPNN 主要面向蛋白质骨架和蛋白质—蛋白质界面设计，原始版本不包含对小分子配体、金属离子和核酸的显式建模。在酶活性位点或精细配体识别设计中，通常需要固定关键功能残基并结合其他优化方法。模型从 PDB 中约 25,000 个聚类的蛋白质结构学习，继承了训练数据的偏好和覆盖范围，对远离天然蛋白结构分布的极端新颖骨架，表现可能有所下降——不过本文测试了 hallucination 产生的新颖骨架、纳米颗粒和人工结合蛋白等多种非天然体系，结果表明泛化能力相当强。此外，ProteinMPNN 倾向于生成高稳定性序列，而某些生物功能需要构象柔性、亚稳态或特定的催化几何，设计时需注意通过固定功能残基来保留这些特性。

ProteinMPNN 对蛋白质设计领域的影响深远。它与结构预测模型构成闭环工作流：ProteinMPNN 从骨架生成候选序列，AlphaFold 或 RoseTTAFold 检验序列是否折回目标结构，通过计算筛选选出最有希望的候选进入实验。论文发表后，作者团队沿同一技术路线开发了 LigandMPNN（加入小分子配体建模）和 NA-MPNN（统一蛋白质与核酸设计），ProteinMPNN 本身也成为蛋白质设计流程中使用最广泛的序列设计工具，其代码已在 GitHub 开源（github.com/dauparas/ProteinMPNN）。这篇论文的核心贡献可以概括为一条完整的证据链：模型设计合理→计算指标提高→蛋白质可表达和折叠→实验结构符合设计→能够实现目标功能。

通讯作者介绍

David Baker 为本文通讯作者，现任华盛顿大学生物化学系教授、蛋白质设计研究所（Institute for Protein Design）所长、霍华德·休斯医学研究所研究员。Baker 于密歇根大学获得学士学位，于加州大学伯克利分校获得博士学位。他的研究方向涵盖蛋白质结构预测、从头蛋白质设计和计算酶设计，开发了 Rosetta 软件套件并推动了 ProteinMPNN、RFdiffusion 等新一代蛋白质设计工具的发展，因在计算蛋白质设计领域的开创性贡献获得 2024 年诺贝尔化学奖。本文第一作者 Justas Dauparas 在 Baker 实验室完成博士后研究期间主导了 ProteinMPNN 的模型设计与全面的大规模实验验证工作。

引用

Dauparas, J., Anishchenko, I., Bennett, N., Bai, H., Ragotte, R. J., Milles, L. F., … & Baker, D. (2022). Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN. Science, 378(6615), 49-56. https://doi.org/10.1126/science.add2187